Determination of a method for extraction of coenzyme Q10 in human plasma: optimization of the use of surfactants and other variables / Determinação de um método de extração de coenzima Q10 em plasma humano: otimização do uso de surfactantes e outras variáveis

Objective: To establish a routine for the extraction of the total levels of CoQ10 in human plasma through the Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC). Methods: Two extraction protocols were tested: a) methanol: hexane and b) 1-propanol. The following parameters were analyzed: extraction temperature (19ºC and 4ºC), extraction tubes (glass and polypropylene), and surfactants (SDS, Triton X-100, Tween-20) at different concentrations, i.e., 1%, 3%, 5% and 10%. Results: The results showed that the method of extraction of CoQ10 in a sample of human plasma at 4ºC, using solvents methanol: hexane (85:15, v/v) in the presence of surfactant Tween-20 at 3% and polypropylene tubes showed better efficiency and reproducibility when compared to the method with 1-propanol. Conclusion: By the analyses performed, it was possible to observe that the addition of the surfactant Tween-20 promoted an increase in the recovery of CoQ10 by the methanol:hexane extraction method. This method showed good reproducibility, with a low coefficient of variation and high sensitivity, since CoQ10 was detected in samples of plasma of a control individual using a UV-type detector. The use of UHPLC equipment allowed a total analysis with total run time of 3.5 minutes, enabling the rapid achievement of results, considered mandatory for laboratory routines.

Objetivo: Estabelecer uma rotina de extração dos níveis totais de CoQ10 em plasma humano por meio da análise por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC). Métodos: foram testados dois protocolos de extração: a) metanol:hexano e b) 1-propanol. Os seguintes parâmetros foram analisados: temperatura de extração (19ºC e 4ºC), tubos de extração (vidro e polipropileno), surfactantes (SDS, Triton X-100, Tween-20) em diferentes concentrações 1%, 3%, 5% e 10%. Resultados: Os resultados mostraram que o método de extração de CoQ10 em amostra de plasma humano, a 4ºC, utilizando-se os solventes metanol:hexano (85:15, v/v) na presença do surfactante Tween-20 a 3% e tubos de polipropileno apresentou melhor eficiência e reprodutibilidade quando comparado ao método com 1-propanol. Conclusão: A adição do surfactante Tween-20 no processo de preparação de amostra promoveu um aumento na recuperação da CoQ10 pelo método de extração metanol:hexano observada pela boa reprodutibilidade das prelicatas, pelo baixo coeficiente de variação e alta sensibilidade uma vez que a CoQ10 foi detectada em amostras de plasma de um indivíduo controle utilizando-se um detector do tipo UV. Além disso, a utilização de um equipamento de UHPLC proporcionou a obtenção de uma análise com tempo total de corrida de 3,5 minutos, o que viabiliza a obtenção rápida de resultados, considerado mandatório para rotinas laboratoriais.

Emprego da cromatografia líquida de alta eficiência na determinação de cortisol sérico em substituição à técnica de radioimunoensaio / High-performance liquid chromatography application for serum cortisol quantification as a substitute for radioimmunoassay

Introdução: A determinação de cortisol nos diferentes fluídos orgânicos tem sido aplicada como auxílio diagnóstico em distintas condições nosológicas em humanos, bem como empregada em estudos envolvendo pesquisa clínica. No intervalo de aplicação clínica, rotineiramente é determinado pela técnica de radioimunoensaio (RIE). Na determinação do cortisol urinário livre essa técnica vem sendo substituída peloemprego da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), principalmente no diagnóstico da síndrome de Cushing. Já para a determinação do cortisol sérico não se têm evidências do emprego da cromatografia líquida em substituição a outras técnicas analíticas. Objetivos: O desenvolvimento de metodologia analítica empregando HPLC no modo fase reversa (RP-HPLC) para a determinação de cortisol sérico em substituição ao RIE visando à redução da geração de resíduos radioativos. Material e métodos: O cortisol foi quantificado diretamente empregando-se RP-HPLC em amostras de soro previamente extraídas com éter utilizando-se acetonido de triancinolona como padrão interno (PI). Utilizou-se coluna analítica BDS-Hypesil-C18® (125 x 4 mm, 5 μm), fase móvel composta de água e acetonitrila (72:28; v/v) a 1 ml/min e detecção a 243 nm. Resultados: O cortisol e o PI apresentaram tempo de retenção de 3,4 e 7,1 min, respectivamente. O coeficiente de variação (CV%) obtido no estudo da precisão foi menor que 10%, e a exatidão apresentou um desvio inferior a 4%. Discussão: O método mostrou-se eficaz e eficiente, com sensibilidade e linearidade na faixa estudada de 2,5 a 60 μg/dl. Conclusão: O método proposto substitui o RIE no intervalo de sua aplicação clínica.

Background: The quantification of cortisol in different organic fluids has not only been applied to different humannosological conditions as a diagnostic aid but it has also been used in clinical research. In clinical application, cortisolis routinely measured by radioimmunoassay (RIA). In the determination of free urinary cortisol this technique has been replaced by the high-performance liquid chromatography mainly in the diagnosis of Cushing syndrome. As to serum cortisol determination, there is no evidence of the application of liquid chromatography as a substitute for other analytical techniques. Objective: The development of an analytical methodology using reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to determine serum cortisol levels as a substitute for RIA in order to reduce radioactive waste. Material and methods: Cortisol was directly quantified by RP-HPLC in previouslyether-extracted serum samples. Triamcinolone acetonide was used as internal standard (IS). The chromatographic separation was developed in a BDS-Hypersil-C18® column (125 x 4 mm, 5μm) using water-acetonitrile (72:28; v/v) as mobile phase at 1 ml/min and steroid peaks were measured at 243 nm. Results: Cortisol and IS presented retention time of 3.4 and 7.1 min, respectively. The precision was less than 10% and accuracy was less than 4%. Discussion: The method was effective and efficient, with good sensitivity and linearity in the concentration range of 2.5 to 60.0μg/dl. Conclusion: The present methodology substitutes RIA at clinical application.

Aplicação da cromatografia líquida de alta eficiência para quantificação direta da 17`alfa'-hidroxiprogesterona sérica / Application of reversed-phase liquid-cromatography (RP-HPLC) to direct quantification of 17-`alpha'-hydroxyprogesterone in serum

A determinação dos níveis séricos de 17`alfa'-hidroxiprogesterona (17OHP) é essencial no diagnóstico laboratorial da hiperplasia adrenal congênita (CAH) por deficiência de 21-hidroxilase. Essa condição é responsável por pseudo-hermaffroditismo em meninas e precocidade sexual em ambos os sexos. A 17OHP foi quantificada diretamente empregando-se cromatografia líquida de alta eficiência no modo fase reversa (RP-HPLC) em amostras de soro previamente extraídas com éter. Utilizou-se coluna ODS-Hypersil® e fase móvel composta de água-metanol (4:6 v/v) com vazão de 1,0 mL/min. A determinação deu-se em 246 nm. A 17OHP apresentou tempo de retenção de 5,6 min. O método mostrou-se eficaz e eficiente com sensibilidade e linearidade (r²=0,9993) na faixa de concentração estudada de 500 a 100.000 ng/dL...